La Tinción Gram

La Tinción de Gram a la fecha continua siendo uno de los exámenes mas simples, sencillos y de bajo costo, pero con gran ayuda diagnostica, aun no se encontró una técnica y/o examen que pueda reemplazarlo y en lo personal dudo mucho que pueda existir uno ahora y en un futuro. Por este motivo el fusil de un verdadero microbiologo siempre sera el microscopio desde su versión mas simple la lupa.

La tinción de Gram, también conocida como coloración de Gram, es una técnica de laboratorio que se utiliza rutinariamente en los estudios microbiológicos de las bacterias. Fue diseñada por Christian Gram, un científico danés, en el año 1884. El objetivo de Gram era conseguir una prueba con la que fuera posible diferenciar diferentes grupos de bacterias para así poder estudiarlas y clasificarlas. La prueba resultó - después de muchos intentos y fracasos - todo un éxito y pronto se convirtió en una técnica muy útil no solo para el estudio de las bacterias, sino también para poder identificarlas rápidamente en una infección y seleccionar el antibiótico mas adecuado para tratarla.

La técnica se basa en aplicar una serie de colorantes a una muestra de cualquier origen (esputo, orina, pus, etcétera) que supuestamente contenga bacterias no identificadas. Los colorantes tiñen la pared de las bacterias de color morado y, tras unos minutos, se realiza un lavado del colorante. Después de eso puede que el colorante permanezca en la pared bacteriana o que se haya ido. En el primer caso permanecería el color morado, y se trataría de bacterias Gram positivas y, en el segundo, la pared tendría un color rosado, y serían Gram negativas.

Estos dos grupos de bacterias son los pilares en los que se basa la clasificación de la amplía mayoría de las bacterias. Cada uno de los grupos responde de forma diferente a cada tipo de antibióticos, por eso es una técnica útil para seleccionar el fármaco antimicrobiano inicial ante una infección. Hay que tener en cuenta que en ciertas situaciones (como la sepsis) es muy importante iniciar un tratamiento antibiótico adecuado de forma precoz, por eso la tinción de Gram se pide de urgencia en muchas ocasiones.

La tinción de Gram también tiene ciertas limitaciones. Algunas bacterias no tienen pared, como por ejemplo las Chlamidias, y no se podrán identificar, al igual que los virus. En esos casos la tinción no coloreará ningún germen. Otro aspecto negativo de la prueba es que no puede identificar el tipo exacto de bacteria responsable de la infección. Para ello es necesario realizar un cultivo microbiológico que se acompaña siempre de un antibiograma para estudiar de forma exacta el antibiótico más efectivo.

CUANDO DEBEMOS REALIZAR UNA TINCION GRAM

Se recomienda realizar una tinción de Gram en todas las situaciones en las que se quiera hacer una primera aproximación en la clasificación de las bacterias aisladas. Es decir que - desde nuestro punto de vista - toda muestra susceptible de ser infecciosa es merecedora de esta prueba.

Neumonias: se puede recoger una muestra de esputo sobre la que se realiza una tinción de Gram para identificar microorganismos responsables.

Infección urinaria: se puede utilizar la coloración de Gram en la orina con sospecha de infección. La muestra debe ser recogida con cuidado para no contaminarla con bacterias de la vagina o del prepucio.

Uretritis: es la infección de trasmisión sexual más frecuente y suele producir secreción a través de la uretra, que se recoge para realizar la Tinción de Gram.

Meningitis: la tinción de Gram teñirá las bacterias que estén infectando el líquido cefalorraquídeo.

Exudado vaginal: aunque en la vagina hay multitud de bacterias, la tinción de Gram puede teñir todas ellas y ver la proporción de Gram positivas y Gram negativas. Así se diagnostican las vaginosis, tan frecuentes en las mujeres con menopausia.

Abcesos: cuando se acumula pus en cualquier lugar se debe drenar y después planificar la antibioterapia si es necesaria, y para ello es muy útil saber qué tipo de bacteria es la causante del cuadro.

Sepsis: en este caso la muestra recogida es la sangre; un tubo pequeño de cada brazo.

FUNDAMENTO DE LA TINCION DE GRAM

Las bacterias gram-positivas y gram-negativas se tiñen de forma distinta debido  las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la celula bacteriana sirve para dar tamaño y forma al organismo asi como para prevenir la lisis osmótica, El material de la pared celular bacteriana que confiere a su rigidez es el peptidoglicano. La pared de la celula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano, generalmente 80 - 90 % y algo de acidos teicoicos. En contraposición la pared de la celula Gram-negativa contiene una capa mucho mas delgada de peptidoglicanos aproximadamente algo de 10 - 20 %, y si esta rodeada de una membrana exterior con gran cantidad de fosfolipidos, lipopolisacaridos y lipoproteina.

TECNICA PROCEDIMENTAL

1.- Realizar un extendido sobre un portaobjetos.

2.- Fijar por acción fisica sobre la llama de un mechero.

3.- Colocar violeta de genciana de 1 - 2 minutos.

4.- Lavar con agua corriente.

5.- Añadir lugol como efecto mordiente por el lapso de 30 segundos a 1 minuto.

6.- Lavar con agua corriente.

7.- Decolorar con alcohol-acetona por 30 segundos (la clave es que sea menos tiempo casi una sola pasada)

8.- Lavar con agua corriente.

9.- Añadir el segundo colorante que es la fucsina-basica 1 minuto.

10.- Lavar con agua corriente.

11.- Secar y observar en microscopio con objetivo de 100x.

El estafilococo feroz

  Publicado por Miguel Vicente el 31 enero, 2009

Autores: Jesús Mingorance y José Ramón Paño (Hospital Universitario La Paz)

Staphylococcus aureus, el estafilococo dorado, es una pequeña bacteria que convive pacíficamente con el ser humano, pero que también puede producir infecciones, en algunos casos muy graves. La historia reciente de los aislados clínicos de S. aureus es un extraordinario ejemplo de evolución de un microorganismo patógeno ocurriendo delante de nuestras narices, y también dentro de ellas… En algunos casos el resultado, el llamado CA-MRSA, es una bacteria resistente a los antibióticos, muy virulenta y por lo tanto muy peligrosa, el “estafilococo feroz”.

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El estafilococo identificado. La Dra. Francoise Perdreau-Remington, directora del laboratorio de Epidemiología Molecular del Hospital General de San Francisco muestra una placa con estafilocco.  Foto: Michael Macor.

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S. aureus es una pequeña bacteria esférica, un coco, del grupo de las gram positivas, capaz de vivir en diversos ambientes, tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas. En relación con el ser humano, se le considera un microorganismo saprófito, que vive sobre la piel, la mucosa nasal y la orofaringe. Ocasionalmente puede producir diversas infecciones en la piel y heridas superficiales pero también, menos frecuentemente, osteomielitis, artritis, endocarditis, neumonías y otras infecciones graves. También es capaz de formar películas (biofilms) sobre superficies inertes, como catéteres ó válvulas cardíacas. Como buen patógeno oportunista, S. aureus está muy bien equipado en lo que se refiere a elementos de ataque y defensa, lo que llamamos habitualmente genes de virulencia, que le permiten penetrar los tejidos y resistir los ataques del sistema inmunológico.

Desde el punto de vista genético, S. aureus es un microorganismo altamente clonal. Como además tiene una gran capacidad de dispersión, la mayoría de los aislados clínicos pertenecen a un puñado de linajes, o clones, de distribución mundial que se parecen mucho entre sí, aunque difieren en el contenido en genes de virulencia y resistencias a antibióticos. Estas diferencias son importantes porque determinan tanto la agresividad de la infección como su susceptibilidad al tratamiento.

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Staphylococcus aureus. Foto: Rocky Mountain Laboratories.

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MRSA: Staphylococcus aureus resistentes a meticilina

Ya en 1948 se detectaron los primeros casos de infecciones por estafilococos portadores de penicilinasa, y por tanto resistentes a la penicilina. En 1961, apenas tres años después de la introducción en la clínica de la meticilina, una variante de la penicilina resistente a las penicilinasas, se describen los primeros casos de cepas resistentes a estos nuevos antibióticos. Desde entonces, estas cepas de S. aureus resistentes a meticilina (abreviado SARM, aunque se utiliza más comunmente el inglés MRSA), se han ido extendiendo por todo el mundo y en algunos países constituyen una fracción importante de todos los aislados clínicos. La resistencia a meticilina la confiere el gen mec, que codifica para una proteína fijadora de penicilina, PBP2a. La proteína PBP2 de S. aureus participa en la síntesis de la pared celular, actividad que en esta bacteria está asociada tanto al crecimiento como a la división celular. Los antibióticos de la familia de los betalactámicos se parecen estructuralmente al sustrato de las PBPs, y se unen a ellas ináctivándolas de manera irreversible. La proteína PBP2a tiene baja afinidad por el antibiótico, y por tanto se mantiene activa en presencia de las dosis que pueden emplearse en la práctica clínica. La expansión de los MRSA desde mediados del siglo XX es un fenómeno sorprendente, no sólo por su rapidez, sino porque se trata en realidad de una serie de ondas epidémicas superpuestas. Se conocen en este momento dos grandes grupos de cepas MRSA que corresponden a líneas evolutivas diferentes pero que parecen estar confluyendo en la actualidad.

HA-MRSA: patógenos relacionados con el ámbito sanitario
Los primeros casos de MRSA se describieron en la década de los sesenta, y eran en su mayoría brotes e infecciones hospitalarias (de ahí el acrónimo HA-MRSA, por hospital-acquired-MRSA). La proporción de estafilococos resistentes frente a los sensibles a meticilina ha ido aumentando con los años, llegando a ser en España un 20-30 % de los aislados clínicos. De forma paralela se ha ido ampliando el entorno en el que se producen las infecciones, y actualmente no se les considera patógenos exclusivamente hospitalarios, sino de forma más general, relacionados con el ámbito sanitario. La definición oficial de HA-MRSA incluye a todos aquellos aislados obtenidos de pacientes que tienen contacto habitual ó reciente (en un período inferior a un año) con hospitales u otras instituciones sanitarias (residencias, centros de diálisis, etc.).
Los HA-MRSA suelen ser responsables de neumonías, infecciones de heridas quirúrgicas, e infecciones asociadas al uso de catéteres. Suelen llevar asociadas resistencias a otros antibióticos, en concordancia con el paradigma de las multirresistencias que establece que son seleccionadas por la tremenda presión antibiótica que se ejerce en los hospitales, y en el ámbito sanitario en general. La multirresistencia es un problema grave porque limita fuertemente las opciones terapeúticas, aunque en el caso del MRSA suelen quedar opciones disponibles como la vancomicina ó el linezolid.

CA-MRSA: el estafilococo feroz
En 1993 se describieron los primeros casos de MRSA no asociados al ámbito sanitario. Los CA-MRSA (de community-acquired MRSA, MRSA adquiridos en el ámbito comunitario) se han extendido desde entonces por todo el mundo. Se manifiestan en brotes epidémicos locales, pero también se dan casos aislados, que habitualmente producen infecciones de piel sin muchas complicaiones. Con cierta frecuencia pueden resultar en infecciones más graves: neumonías necrotizantes, osteomielitis, endocarditis, etc. No suelen llevar asociadas resistencias a otros antibióticos y se caracterizan por ser muy virulentos. Uno de los clones más agresivos es el USA300, que se ha extendido en los últimos años por los Estados Unidos, y ha sido descrito ya en Europa en varias ocasiones. El riesgo de infección por USA300 es mayor entre los hombres homosexuales sexualmente activos, por ello ha sido presentado por algunos medios de comunicación como el SIDA del siglo XXI ó la nueva epidemia de los homosexuales. Sin embargo, la infección no se limita, ni mucho menos, a la población homosexual, puede afectar a cualquier persona, y recientemente ha entrado en el ámbito sanitario, siendo ya responsable de diversos brotes epidémicos hospitalarios en Estados Unidos. La aparición de brotes hospitalarios producidos por CA-MRSA distintos al USA300 ha sido descrita en varias ocasiones en diversos lugares de todo el mundo, y parece indicar que los CA-MRSA se están introduciendo en el ámbito sanitario.
Los análisis genéticos muestran que USA300 es un grupo clonal, es decir, todos los aislados provienen de un ancestro común. Sin embargo, no es el único clon de CA-MRSA, varios análisis realizados con aislados de todo el mundo muestran que existen diversos clones de CA-MRSA, y que han surgido de manera independiente en repetidas ocasiones.

La evolución del estafilococo feroz
La evolución de los CA-MRSA es un tanto enigmática. Los diversos clones se han originado de manera independiente, y lo han hecho fuera del ámbito sanitario, donde la presión antibiótica es baja. Esto sugiere que los CA-MRSA han surgido en respuesta a un modo de selección puntual. Si los CA-MRSA tienen mayor transmisibilidad ó capacidad de dispersión que el resto de los estafilococos, como sugiere la rapidez con la que se han extendido por todo el mundo, la selección local y limitada en el tiempo que se produce cuando una persona recibe un tratamiento antibiótico podría ser suficiente para mantener el gen de resistencia en la población, incluso si, como es el caso, la mayoría de los portadores no están tomando antibióticos. No hay que olvidar que el 80% del consumo total de antibióticos se produce fuera del ámbito hospitalario, y que, aunque globalmente la presión antibiótica en el medio comunitario sea baja, existen en todo momento una gran cantidad de individuos recibiendo tratamientos antibióticos por diversas infecciones, que actuarían como puntos de selección y amplificación de la población MRSA. Este fenómeno de “selección puntual y adaptación global” sería análogo a los procesos de selección periódica estudiados ampliamente por los genetistas, y aunque destaca por la rapidez con la que se ha producido la dispersión geográfica hasta alcanzar el nivel de pandemia y por la gravedad de las infecciones que puede producir, no es un fenómeno exclusivo del estafilococo. Otras bacterias en las que se han seleccionado resistencias a antibióticos en el ámbito comunitario son el neumococo (Streptococcus pneumoniae) resistente a betalactámicos, ó la Shigella multirresistente. No conocemos cuales son los factores que determinan la selección de un microorganismo y no de otro, ó qué antibióticos y en qué cantidades favorecen la selección de unas u otras resistencias en la comunidad. Estas son, sin duda, cuestiones difíciles de estudiar pero que deben abordarse si queremos llegar a comprender por qué se extienden las resistencias a antibióticos.

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GLOSARIO

Aislados clínicos: en microbiología clínica se llama aislados clínicos a las cepas ó clones obtenidos de muestras de pacientes y a los que se atribuye un papel causal en una infección.